Mots-Clés

épigénétique modélisation moléculaire CRISPR-Cas9 enzyme épigénétique histone H3

Description

Contexte scientifique, état de l'art : L’information épigénétique est portée par la chromatine constituée de protéines, les histones, autour desquelles s’enroule l’ADN (Luger et al., 1997). Le maintien de l’épigénome est permis par de nombreux mécanismes dont la compréhension est encore parcellaire. Les histones portent une partie de l’information épigénétique via leurs modifications post-traductionnelles et leurs isoformes (notamment H3.1 et H3.3 pour l’histone H3). L’organisme modèle qui sera utilisé pour le stage est la diatomée Phaeodactylum tricornutum qui dispose d’un génome séquencé et annoté (Giguere et al., 2022). Les isoformes H3.1 et H3.3 sont produites à partir de 3 gènes et un gène, respectivement, chez cette diatomée. Le séquençage du génome a permis d’identifier de nombreux candidats d’enzymes impliquées dans le dépôt et le retrait des modifications post-traductionnelles portées par les histones (Rastogi et al., 2015). Cependant, seule l’enzyme responsable du dépôt de la marque H3K27me3 (triméthylation de la lysine 27 de l’histone H3) est formellement identifiée à ce jour (Zhao et al., 2021).

Définition de la problématique et objectifs du projet : Le projet proposé vise à étudier le maintien de l’épigénome via l’étude des histones H3 et des enzymes impliquées dans le dépôt et le retrait des modifications post-traductionnelles portées par les histones H3. Des lignées perte-de-fonction pour les différentes isoformes d’H3 seront produites par CRISPR-Cas9  afin d’évaluer la participation de chaque isoforme sur l’abondance des histones H3. Pour cela, l’utilisation de l’outil CRISPR-Cas9 sera mise en œuvre. Il est utilisé avec succès chez la diatomée P. tricornutum (Rastogi et al., 2016; Sharma et al., 2018). Un protocole de transgénèse par conjugaison bactérienne a été mis au point au sein de l’équipe « Épigénomique des Microalgues et Interactions avec l'environnement » par C. Duc. 

Grandes étapes du stage et résultats attendus : Le stagiaire caractérisera les différents mutants obtenus. Pour cela, une analyse par RT-PCR quantitative sera réalisée pour évaluer si ces mutants présentent une diminution ou une extinction du gène ciblé par l’approche CRISPR-Cas9. Puis une mesure de l’expression de chaque gène codant les isoformes d'H3 sera faite par RT-PCR quantitative afin d’évaluer s’il y a une compensation dans l’expression des gènes dans les différentes lignées perte-de-fonction. Chez ces lignées, une analyse par Western blot de l’abondance des histones H3 sera effectuée afin d’estimer si la mutagenèse d’un ou plusieurs gènes affecte le niveau global des histones H3. Une analyse de la croissance des différentes lignées perte-de-fonction sera effectuée afin d’évaluer si la mutagenèse d’un ou plusieurs gènes affecte la physiologie de P. tricornutum. En parallèle de ces aspects expérimentaux, des approches par recherche d’orthologue(s) et modélisation moléculaire permettront d’identifier les enzymes impliquées dans le dépôt et le retrait des modifications post-traductionnelles portées par les histones H3.

Le stage sera encadré pour la partie modélisation par Stéphane Télétchéa et pour la partie expérimentale par Céline Duc

Profil

• Connaissances théoriques en biochimie pour la partie expérimentale (RT-PCR quantitative, Western Blot)
• Compétence en programmation
• Linux / Unix
• Développement de workflows (nextflow).
• Anglais scientifique.